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支原体污染常用检测方法
来源:新浪博客上海炎熙生物| 更新时间:2018-06-05
     支原体(mycoplasma):又称霉形体,在分类学上是处于细菌和病毒之间的一种微生物,是目前发现的最小的最简单的原核生物。支原体细胞中唯一可见的细胞器是核糖体。支原体直径一般在0.2-0.8 ?m之间,呈高度多形性,有球形、杆形、丝状、分枝状等多种形态。支原体缺乏细胞壁,有变形能力,能通过滤菌器、可在无生命培养基中生长繁殖,在自然界分布极为广泛。可对人、动物、植物、昆虫等治病,造成极大危害。
    支原体是细胞培养中常见的一种污染源。细胞培养中的支原体污染可能来自培养基、血清或实验操作者,会影响细胞生长率、细胞形态、基因表达、细胞代谢和细胞活力。

    支原体对细胞的影响,主要从两方面考虑:一方面是对细胞的直接影响,细胞被支原体污染后,增殖缓慢,部分细胞变圆,从瓶壁上脱落,部分细胞虽然表面变化不十分明显,实际上潜伏着多方面的危险;另一方面,支原体可以通过消耗培养基中的精氨酸,抑制细胞DNARNA的合成,降低细胞的抵抗力。总的来说,支原体污染对细胞造成的影响是多方面的:包括代谢、免疫或生化特性、生长状况、酶的作用途径、细胞膜的组成、染色体结构、转染效率、以及细胞存活等多方面的改变。

    支原体能轻易地通过标准滤膜,同时也能拮抗绝大多数的抗生素。而且,支原体污染细胞后,培养液可不发生混浊,多数情况下细胞病理变化轻微或不显著,细微变化也可由于传代、换液而缓解,因此易被忽视。因此,在细胞培养过程中,对支原体的防范、检测和去除非常棘手,也非常重要。

    污染实验室培养细胞的支原体主要有八种,通常用于细胞培养的绝大多数抗生素都对其无效。例如青霉素主要作用于细菌细胞壁,但支原体没有细胞壁因此就不受影响。无懈可击的细胞培养技术始终是预防支原体污染的最佳方式,另外及时找出受到支原体污染的培养物也很重要,这样才能在污染扩散前快速采取有效措施。以下就为您介绍几种在细胞培养中检测支原体的常用方法。

1  分离培养法

    分离培养法是支原体检测的金标方法,其检测精确度最高。这种方法是从可疑的细胞培养体系中取样,并接种到最适宜支原体生长的琼脂平板上。如果样本中含有支原体,它们就会在这种琼脂平板上疯狂生长,最终形成明显可见的特征性菌落。分离培养法基本不会出现假阴性结果,因此被誉为支原体检测金标准。不过分离培养法也存在两个弊端,一是检测时间太长,支原体要长出明显克隆至少需要4周时间。二是尽管可以检测绝大多数支原体种类,分离培养法也有力所不及的时候,例如支原体M. hyorhinis尚不能在体外进行培养,因而不能使用这个方法。

    如果你实在不想等这么久,或者希望在分离培养法的等待过程中先拿到初步结果,你可以试一试DNAPCR或酶学检测方法。不过需要注意的是,上述检测方法都不能单独检出所有类型的支原体,而且灵敏度也没有分离培养法高,所以最好结合使用两种方法以获得最可靠的检测结果。

 

2  荧光法DNA检测

    荧光法DNA检测一般需要几天时间。将可疑样品与指示细胞共同培养,DNA检测所用的指示细胞通常是细胞质区域较大的Vero细胞,如果原样本中含有支原体,那么当细胞DNA被荧光染料(如Hoechst染料)染色时,就可以在指示细胞核周围以及细胞膜周围、培养基中观察到荧光斑点或荧光颗粒。分离培养法用来检测支原体M. hyorhinis菌株并不可靠,而DNA法可以准确的将其检测出来。这个方法的缺点是死亡细胞释放出来的DNA会造成很大干扰,使得判断误差发生率大约在30%左右,因此使用这个方法需要一定的经验。

 

3  PCR

    PCR法可以检测所有种类的菌株,包括M. hyorhinis菌株。PCR法检测支原体只需几个小时,是最灵敏的支原体检测方法。该方法采用针对支原体DNA的引物用PCR检测可疑样本,其中PCR引物通常针对支原体的16S rRNA基因的保守区域。在凝胶电泳过程中,支原体DNA会显示为特异性条带,以此指示支原体的存在。PCR法可以检测所有种类的支原体,快速,灵敏度最高,缺点是不能区分支原体的死活。而且因为PCR法过于灵敏,在操作过程中容易产生假阳性,所用的器具、枪头、管壁等也都可能因为携带微量的支原体DNA而导致假阳性现象。

 

4  酶学检测和ELISA

    酶学检测是将可疑样本添加到特定底物中,在这一体系内支原体的酶可以将ADP转化为ATP,随后能利用ATP发光的luciferase酶就可以指示支原体的存在。这个方法的检测速度最快,大概半小时即可完成,死亡的支原体不会造成干扰。缺点是灵敏度比PCR法低,而且需要的检测发光的仪器尚未普及。

    ELISA也能用于支原体检测,以ELISA法为基础的支原体检测一般使用针对支原体16S rRNA基因的带标记探针或抗体,来检测培养物中是否含有支原体。这个方法现在已较少使用。

 支原体定期检测

    支原体污染会使培养细胞慢慢枯萎,因此对培养细胞定期进行支原体检测非常重要。一般来说每13个月就应该进行一次例行支原体检测。将定期支原体检测常规化坚持下去,是细胞培养实验室应对支原体污染的关键。对新引进的细胞系应进行检测,防止引入外来的污染源。对于冻存的细胞,在冻存之前或者放入液氮之前进行检测,以免以将含支原体的细胞作为种源保存。

 

如何预防支原体污染

    支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染(一些支原体在人体是正常菌群)、培养基的污染、污染支原体的细胞造成的交叉污染、实验器材带来的污染和用来制备细胞的原始组织或器官的污染。

    细胞培养工作中,主要从以下几个方面来预防支原体的污染:控制环境污染;严格实验操作;细胞培养基和器材要保证无菌;在细胞培养基中加入适量的抗生素。最好的预防支原体污染的方法就是严格操作,避免污染。

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